- 優(yōu)質(zhì)血清助力細(xì)胞學(xué)實驗 -

上期內(nèi)容里，我們介紹了細(xì)胞轉(zhuǎn)染的基本基本知識，包括概念、應(yīng)用場景以及各種方法之間的優(yōu)劣對比。

本期內(nèi)容，進一步為大家介紹常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法——實操篇。

- 細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用方法 -

陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染

原理：陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染是目前常用的轉(zhuǎn)染方式之一。

陽離子脂質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)由帶正電荷的頭基和一個或兩個烴鏈組成。

帶正電荷的頭基與帶負(fù)電荷的核酸通過靜電作用形成復(fù)合物。

經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)吞作用進入細(xì)胞。

實驗過程：將DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和轉(zhuǎn)染試劑分別在不同的管中稀釋→將兩者混合形成混合物→將形成的混合物加入細(xì)胞中，脂質(zhì)體的正電荷有助于幫助復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜上→復(fù)合物經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞作用進入細(xì)胞→檢測基因表達(dá)或沉默情況。

磷酸鈣共沉淀

原理：將DNA與氯化鈣在磷酸緩沖鹽水中混合形成磷酸鈣-DNA沉淀物，然后將其分散在培養(yǎng)的細(xì)胞上，磷酸鈣促進共沉淀物中的縮合DNA與細(xì)胞表面的結(jié)合，DNA通過內(nèi)吞作用進入細(xì)胞。

實驗過程：將氯化鈣和DNA混合，以可控的方式加入磷酸緩沖液→在室溫下孵育，以形成極細(xì)，可溶的共沉淀微粒→將磷酸鈣-DNA沉淀物加入細(xì)胞中，后者能黏附到細(xì)胞膜表面→共沉淀物經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞作用進入細(xì)胞→檢測基因表達(dá)或沉默情況。

病毒轉(zhuǎn)染

原理：對于用脂質(zhì)體不能實現(xiàn)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可以采用病毒轉(zhuǎn)染。腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體已廣泛用于哺乳動物細(xì)胞體內(nèi)外的基因轉(zhuǎn)染。

 

實驗過程：通過基因克隆方法獲得重組病毒表達(dá)載體→轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系，擴增并分離得到重組病毒顆粒→純化并滴定病毒液→轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細(xì)胞（含病毒特異性的受體）→從培養(yǎng)基中移除病毒→檢測基因表達(dá)或沉默情況。

電轉(zhuǎn)

原理：利用電脈沖在細(xì)胞膜上形成暫時的孔使核酸物質(zhì)能穿過孔進入細(xì)胞。

實驗過程：利用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細(xì)胞→對含有核酸，緩沖液，細(xì)胞的混合物給予合適的電脈沖→電脈沖在細(xì)胞膜上形成電勢差，誘導(dǎo)產(chǎn)生暫時的孔使核酸進入細(xì)胞→將細(xì)胞返回到生長培養(yǎng)基中，使其慢慢恢復(fù)→檢測基因表達(dá)或沉默情況。

血清在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的重要性不言而喻：

• 提供對維持細(xì)胞指數(shù)生長的激素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物，以及主要的低分子營養(yǎng)物。

• 提供結(jié)合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)節(jié)它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。

• 有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起到解毒作用。

• 是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來源。

• 起酸堿度緩沖液作用。

• 提供蛋白酶抑制劑，使在細(xì)胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細(xì)胞不受傷害。

• 參與細(xì)胞凍存。

• ......

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